胃癌的早期診斷與預警芯片

　　建立胃癌早期診斷及預警系統的研究

　　一、主要研究內容和目標

　　1．主要研究內容

　　（1）正常胃粘膜(包括胃窦部、胃體、胃幽門部粘膜)到癌前變、再到胃癌的差異表達基因的分離與克隆；

　　（2）建立正常胃粘膜（包括胃窦部、胃體、胃幽門部粘膜）到癌前變、再到胃癌的差異表達基因圖譜；

　　（3）正常胃粘膜（包括胃窦部、胃體、胃幽門部粘膜）到癌前變、再到胃癌的特征性差異表達基因的篩選；

　　（4）所獲差異表達基因植於芯片，運用芯片技術對臨床標本進行檢測並建立相關數據庫；

　　（5）差異表達基因的表達水平在胃粘膜病變過程中的變化規律。

　　2．研究目標

　　建立胃癌早期診斷及預警系統。

　　二、研究的必要性及重要意義

　　胃癌的發病率在我國居惡性腫瘤之首，在世界居第二位。臨床醫學一直強調胃癌的早期診斷與治療,以便降低死亡率，基礎醫學把胃癌發病機制的研究列為重點並取得一些重大成果，初步闡明了100多種基因與胃癌發生發展有關；發現一些致胃癌的物質；研制出一批胃癌單抗，促進了消化醫學的發展。但臨床的現狀是：就診的患者大多處於胃癌的中晚期，療效不佳。胃癌的早期診斷難題還遠未解決。基礎醫學研究目的是提高醫學質量，如何解決胃癌患者的早期診斷難題呢？我們認為：只有建立胃癌的預警系統，才能夠實現這一目標。

　　現代分子生物學研究表明：人類基因組約由10萬左右的不同基因組成，這些基因的選擇性表達決定了機體整個生命過程，基因表達的變化處於控制生物學調節機制的中心位置。基因表達水平的變化是最根本的變化，也是最敏感的變化，反映了機體特定階段的生命特征。胃癌是一種基因病，是由多種癌基因抗癌基因參與、多階段多途徑協同作用，使得胃粘膜逐步發展到癌前變再發展到胃癌的這樣一個演變過程。正常胃粘膜到癌前變過程及癌前變至胃癌過程皆存在特征性的差異表達基因，只要找出這些基因並闡明這些基因表達水平的變化與胃癌發生發展不同階段的相互關系及其規律，建立這些基因變化規律的數據庫就完全可能預報胃癌。

　　開展此研究，對提高部隊戰斗力具有重要意義。部隊是個戰斗集體，胃腸系統疾病嚴重影響干部戰士健康，此研究的成果，可預測胃腸疾病狀態，為疾病早期預防奠定了基礎；此研究結果帶來的經濟效益與社會效益都是十分巨大的，同時為解決其它腫瘤的預警難題提供了新的思路，具有深遠的影響。

　　三、同類研究工作國內外研究現狀與存在的問題

　　1.胃癌的國內外研究現狀

　　胃癌是個多因素的疾病，與140多種基因及其蛋白產物密切相關，包括：MAGE-1、2、3，ras、c-myc、met、k-sam、HER2/neu、c-erb-2、midkine等癌基因；p53、p16、p21、DCC等抗癌基因；fas、bcl-2、bcl-x(s)、cycloxygenase-2、cyclinA、cyclinB1、p34cdc2等凋亡及細胞周期相關基因；IRF-1、EGF-1、PDGF-A、AgNOR、b -TGF-1、high-mobility-group-1、bFGF、TGF-b II 型受體、TFF2等生長因子及其受體基因；E-cadherin,caltractin gene、Trypsinogen、Erk、HEK、MMP-2、MAPK、MKP-1、Protein-tyrosine kinase、protein-serine/threonine等信號轉導相關基因及蛋白；還涉及cagA、PCNA、UGTA、copA、MIB、p300、BstUI等蛋白；還涉及免疫因素如IL-4、CD24、CD44、IL-8等；胃癌的轉移與nm23、CD44、p53、muc1、cerB-2等密切相關。胃癌相關基因主要以擴增、重排、缺失等方式導致其mRNA及蛋白呈高表達、低表達或不表達，來作用於不同階段的不同環節，引起轉導信號紊亂，最終導致胃癌發生發展。因此，我們認為：胃癌從本質上說是多因素引起相關基因表達水平改變的產物，尋找胃癌特異表達基因並闡明其功能具有現實意義。國人在胃癌單抗制備及其應用方面取得重大進展，同時在跟綜國際研究過程中進行了一些胃癌相關基因的研究以及HP與胃癌關系的研究，取得了一些進展；我們從95年開始運用mRNA差異展示技術從事胃癌表達基因的研究，分離出胃癌相關基因片段154個，完成部分片段的測序,篩選20個是新序列並被GenBank接受（接受號為AF054162-AF064172，AF071052-AF071058），對其中的二個基因片段進行了cDNA文庫的篩選及染色體定位，運用RT-PCR及RNA 雜交技術對68例胃癌及癌旁組織與100例活檢胃粘膜標本進行了檢測，篩選出6個特異性好、組合檢出符合率達92.3%的新基因片段,組成胃癌早期預警系統，這6個基因序列已被GenBank接受，並申請了中國專利（接受號為98112922.6）。我們在HP與胃癌關系的研究方面也取得了一些進展。

　　正常胃粘膜到癌前病變再到胃癌方面的研究進展：正常胃粘膜到癌前變的研究很少，98年日本人TAKESHI WATANABE等把幽門螺桿菌感染Mongolian Gerbils胃粘膜，62周後37%的鼠出現胃癌病理改變；化學物質如raphe pallidus 等可誘導胃粘膜病變；年青人的胃粘膜與老年人胃粘膜存在ep37家族基因的表達水平不同；還有數個基因在胃潰瘍粘膜中表達異常；胃粘膜癌前變到胃癌過程的研究也很少，在癌前變粘膜中存在Protein-tyrosine kinase 家族基因的高表達，如ERK，GCYS-18等。

　　2.存在的問題

　　正常胃粘膜到癌前變再到胃癌過程基因變化的研究還是比較少，胃癌的研究還局限於單個基因在胃癌組織中變化的研究，系統化的研究還是少，只有對正常胃粘膜到癌前變再到胃癌過程基因變化規律進行闡明，才有可能解決胃癌的早期診斷難題。

　　四、軍隊開展此研究所具備的條件

　　1.取材方便，病歷完整。

　　在附屬醫院門診，各種胃病患者皆能見到，各種胃病標本皆能收集到，特別是胃鏡檢查的開展，活檢胃粘膜標本（胃窦、胃體、胃幽門）特別易獲得，而且病理資料與病歷資料都完備，為開展此研究奠定了基礎。

　　2.克隆技術發展為差異表達基因的獲取提供了技術保障。

　　差異表達基因克隆技術十分成熟，特別是差異展示技術的發展與成熟，為短期內分離並克隆正常胃粘膜到癌前變、再到胃癌的差異表達基因奠定了基礎。

　　3.芯片技術的發展與成熟為差異表達基因的臨床研究奠定了基礎。

　　芯片技術的發展與成熟為大量基因的功能性研究提供了條件，同時也提高了效率，為短期內獲得大量數據提供了可能。

　　4.部隊的科研管理及嚴格的組織性為多單位科研協作完成課題奠定了基礎。

　　五、本研究經費概算及建議承擔單位

　　1.經費概念

　　(1)胃粘膜(胃窦、胃體、胃幽門)到胃癌前變（胃窦、胃體、胃幽門）差異表達基因的分離與克隆，需經費50萬元；

　　(2)胃癌前變（胃窦、胃體、胃幽門）到胃癌差異表達基因的分離與克隆，需經費50萬；

　　(3)克隆的差異表達基因在臨床標本中的檢測及其臨床意義研究，需經費50萬元；

　　 特異性差異表達基因的篩選；

　　­ 差異表達基因臨床運用數據庫的建立；

　　® 相關檢索分析軟件的開發與運用。

　　2.建議承擔單位

　　第四軍醫大學全軍基因診斷技術研究所、北京醫科大學腫瘤醫院、西安市中心醫院、西京醫院消化病研究所等單位聯合承擔。

　　第四軍醫大學全軍基因診斷技術研究所運用DD-PCR技術分離並克隆了部分胃癌與癌前變粘膜之間的差異表達基因，對DD-PCR技術掌握很熟練，分離出胃癌相關基因片段154個，完成部分片段的測序,篩選20個是新序列並被GenBank接受（接受號為AF054162-AF064172，AF071052-AF071058），對其中的二個基因片段進行了cDNA文庫的篩選及染色體定位，運用RT-PCR及RNA 雜交技術對68例胃癌及癌旁組織與100例活檢胃粘膜標本進行了檢測，篩選出6個特異性好、組合檢出符合率達92.3%的新基因片段,初步組成胃癌早期預警系統，這6個基因序列已被GenBank接受，並申請了中國專利（接受號為98112922.6）。

　　對完成基因篩選工作奠定了基礎；北京醫科大學腫瘤醫院、西安市中心醫院、 西京醫院消化病研究所承擔並完成了多項重點科研課題，具備完成此研究的標本收集及有關技術條件。

　　胃癌早期診斷及預警基因芯片

　　胃癌的發病率在我國居惡性腫瘤之首，在世界居第二位。研究表明：胃癌是一種基因病，正常胃粘膜到癌前變及胃癌皆存在特征性差異表達基因，找出這些基因並闡明這些基因表達水平的變化與胃癌發生發展不同階段的相互關系及其規律，建立起這些特征基因變化規律的數據庫就能預報胃癌。

　　籍此，我們利用基因打獵技術獲得了229個胃癌發展各階段的特異基因，並將這些基因種植到特殊處理的載體上，制備成基因芯片，從而實現對胃癌的早期診斷和預警。

　　該芯片的研制成功，對於胃癌高危人群的普查，胃癌的早期診斷及治療效果分析，預後評價等均有重大的現實意義，同時也可產生良好的經濟效益。