健脾益腎顆粒

研究健脾益腎顆粒對胃癌術後復發轉移及生存期的治療

[關鍵詞]胃癌;腫瘤復發;轉移;生存期;健脾益腎方

胃癌患者根治性治療之後多出現脾氣虧虛。此外,患者雖然進行了根治性治療,但體內仍殘存著腫瘤細胞或突變基因,這些突變基因可能先天虧虛所致,日久腫瘤細胞仍會生長繁殖、轉移、復發。腎為先天之本,脾胃為後天之本。中國中醫科學院廣安門醫院腫瘤科針對腫瘤患者根治性治療之後的特點制定了健脾益腎的中醫治則。本實驗在過去實驗和臨床研究基礎上進一步采用具有淋巴道轉移的小鼠前胃癌模型,在小鼠的爪墊皮下移植後,待原發瘤生長到一定大小時手術切除原發瘤,再應用健脾益腎方進行治療,觀察其對局部復發和遠處轉移的治療作用及對生存期的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物

清潔級近交系6～7周615小鼠,雌雄各半,體質量18～24g,購自中國醫學科學院藥品鑒定所實驗動物中心(動物許可證號SCXK京200020010號)。

1.2瘤株

小鼠前胃鱗癌細胞,中國醫學科學院基礎醫學研究所病理室用甲基卞基亞硝胺灌胃誘發而成,移植率100%,傳代品系615小鼠,為具有自發肺轉移潛力的高轉移細胞株,肺轉移率為86%～90%,侵襲周圍肌肉組織,中國醫學科學院基礎醫學研究所病理室提供。

1.3藥物

實驗用健脾益腎方藥為深棕色浸膏,生藥濃度2.24g/g。由黨參、白術、枸杞子、女貞子、補骨脂、菟絲子組成。制劑由中國中醫科學院廣安門醫院制劑室提供。該方藥物組成和劑量同北京長城制藥廠生產的已上市的健脾益腎顆粒。陽性對照化療藥物為氟脲嘧啶注射液,10ml/支,0.25g/支,由上海旭東海普藥業有限公司生產。批號:041a008。

1.4小鼠前胃鱗癌細胞細胞移植

從液氮中復蘇小鼠前胃鱗癌細胞,接種於4只615小鼠右腋下,待局部腫瘤長至直徑1～1.5cm大小時處死動物,8～12d後,無菌取出新鮮生長良好無壞死的腫瘤組織,用生理鹽水洗淨後,剪碎,加生理鹽水用玻璃均漿器研磨成單細胞懸液,過200目不銹鋼篩網,調整細胞數4×106/ml,台盼藍拒染試驗示活細胞大於95%,取0.05ml瘤細胞懸液接種於每只615小鼠左側後肢爪墊內側皮下(移植時避免細胞懸液外溢)。爪墊皮下移植,是獲得淋巴道轉移的最佳途徑,該模型為肺高轉移腫瘤模型[1]。

1.5手術切除原發瘤

參考文獻[2],並進行預實驗,發現爪墊皮下腫瘤10d時生長明顯,侵襲程度達Ⅲ～Ⅳ[1]。切除局部原發瘤,造成原發瘤切除後,體內仍有殘存瘤細胞存在,與臨床腫瘤患者在進展期手術切除後的情況相似。手術方法是先用絲線在小鼠小腿下端原發瘤上端結扎緊,再用手術剪從踝關節處切除整個左側後肢爪墊(即切除原發瘤),手術時注意避免切口處流血。

1.6實驗分組

共進行兩批實驗,第1批實驗在切除原發瘤後,采用隨機數字表將60只小鼠隨機分為3組,每組20只。(1)模型組:從術後當日開始,每天給生理鹽水0.3ml,連續灌胃15d。(2)化療組:從術後當日給藥,給予氟脲嘧啶(52FU)注射液,按照20mg/kg劑量腹腔注射0.2ml,1次/d,連續7d。同時從術後當日開始,每天給生理鹽水0.3ml,連續灌胃15d。(3)健脾益腎方治療組:從術後當日給藥,給予健脾益腎方,藥物濃度1g/ml,灌胃1次/d,每次0.3ml(相當於人臨床用量的15倍),連續灌胃15d。第2批實驗分組和施藥方法同第1批實驗,每組15只。給藥結束後,連續觀察至術後60d[3]。

1.7檢查指標

第1批實驗觀察計算荷瘤小鼠術後肺轉移抑制率和復發瘤瘤質量抑制率,術後15d,頸椎脫臼處死全部小鼠,取肺,4%甲醛固定,石蠟包埋,切片,HE染色,組織學觀察肺腫瘤轉移情況和轉移分級[1],計算肺轉移率;從荷瘤小鼠左下肢剝離復發瘤稱重,計算抑瘤率。局部復發瘤是指前胃癌細胞在爪墊皮下接種後10d,從踝關節處切除局部原發瘤後,少量殘存的瘤細胞又在手術部位不斷增殖生長而形成局部復發瘤。轉移抑制率=[1-治療組轉移率(%)/模型組轉移率(%)]×100%;復發瘤瘤質量抑制率=[1-治療組復發瘤瘤質量/模型組復發瘤瘤質量]×100%。第2批實驗觀察荷瘤小鼠術後生存期。記錄小鼠存活時間,計算各組平均生存時間和中位生存時間,按下列公式計算生命延長率:生命延長率=(治療組平均生存天數-模型組平均生存天數)/模型組平均生存天數×100%。

1.8統計學方法

采用SPSS11.5軟件進行統計學處理,計量資料用x±s,組間比較采用單因素方差分析,多個率的比較采用χ2檢驗,等級資料采用多個獨立樣本秩和檢驗(Kruskal2WallisTest),生存期進行Kaplan2Meier生存分析。

2結果

2.1術後15d前胃癌615小鼠術後肺轉移抑制作用

在原發瘤切除後,連續給藥15d,在術後15d時全部處死小鼠,檢查肺轉移情況。模型組、化療組和健脾益腎方治療組肺轉移率分別為94.4%、73.7%和68.4%;化療組轉移抑制率為21.9%,健脾益腎方治療組為27.5%。健脾益腎方治療組和化療組轉移率與模型組相比差異無統計學意義(P>0.05),但治療後轉移率低於模型組。從轉移程度來看,健脾益腎方治療組和化療組與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05)。說明健脾益腎方對615小鼠前胃癌術後肺轉移有一定的抑制作用,而且可以推遲肺轉移。病理切片HE染色顯示:模型組肺內廣泛分布10個以上轉移灶,而且有大轉移灶存在,整個肺葉由瘤組織取代。健脾益腎方治療組和化療組轉移灶數量比模型組減少,直徑減小,散在分布。

2.2術後15d前胃癌615小鼠術後復發瘤抑制作用

模型組、化療組和健脾益腎方治療組復發瘤瘤質量分別是(1.01±0.93)、(0.26±0.52)和(0.35±0.35)g,健脾益腎方治療組和化療組與模型組相比差異有統計學意義(P<0.01)。模型組、化療組和健脾益腎方治療組復發率分別是94.44%、68.42%和78.95%,三組相比差異無統計學意義(P>0.05)。健脾益腎方治療組復發瘤抑制率為65.35%,化療組為74.26%。實驗結果表明健脾益腎方和52FU均可明顯降低前胃癌在615小鼠下肢局部復發。

2.3前胃癌615小鼠生存期觀察

與模型組相比,健脾益腎方治療組與化療組荷瘤小鼠術後生存期及中位生存期明顯延長,生命延長率為100%和64.71%,以健脾益腎方治療組效果更明顯。從Kaplan2Meier曲線圖,能清晰看出不同的變化趨勢。

3討論

本課題實驗動物選擇近交系615小鼠,其造價低、飼養簡便、生命力強,同時考慮還要觀察健脾益腎中藥對細胞免疫的干預作用,因此未選用裸鼠,有利於推廣應用。本課題選用將前胃癌細胞接種於615小鼠後肢爪墊皮下,有利於研究者肉眼直接觀察原發瘤侵襲程度,隨時在適當的時間行截肢術,比將腫瘤接種於原位的方法操作簡單易行。只要原發瘤結扎緊,截肢後一般出血極少,傷口無需特殊處理,術後1～2d恢復完好,此術式對動物損傷小,耐受性好。胃癌的擴散以直接浸潤蔓延及淋巴道轉移為主,晚期也可發生血行及種植轉移。爪墊皮下移植,是獲得淋巴道轉移的最佳途徑,該模型為肺高轉移腫瘤模型,較好地模擬了胃癌淋巴轉移的方式。建立615小鼠前胃癌術後復發轉移模型也將為評估、規范臨床用藥及深入研究中醫藥影響腫瘤轉移復發的作用機制奠定基礎。

從本研究結果看,健脾益腎顆粒對手術後局部腫瘤復發及肺轉移有一抑制作用,雖然轉移率和復發率與模型組差異無統計學意義,但對復發和轉移程度的控制較模型組差異有統計學意義。健脾益腎顆粒治療組生存期和生存質量都明顯優於模型組和化療組,術後無論中藥治療期間還是治療後小鼠毛色光澤,活動靈活,即使出現復發轉移時,其狀態比模型組和化療組要好。說明健脾益腎中藥具有防治腫瘤復發和轉移、提高腫瘤患者生活質量、延長生存期的作用。

溫馨提示：腫瘤屬疑難疾病，請患者一定選擇正規醫院或專科門診，找專業腫瘤科室的醫生診治，遵醫囑按時定量服用藥物，勿隨意購藥或“組合用藥”，以免延誤病情，造成難以彌補的遺憾。中國中醫科學院抗腫瘤成果咨詢電話：010－84027660